Estratégias para a avaliação de extratos de polifenóis em modelos in vitro de câncer do sistema digestivo
Resumo
Introdução: Os polifenóis são compostos encontrados naturalmente em alimentos como frutas, legumes, chá, vinho e chocolates, aos quais são atribuídos benefícios para a saúde humana devido à sua capacidade antioxidante. O câncer do sistema digestivo está entre a terceira e a quinta principais causas de morte na população, o que levou a um interesse crescente em estudos destinados a encontrar compostos polifenólicos que ajudem a prevenir ou tratar esse tipo de câncer.
Objetivo: Identificar as estratégias disponíveis para a avaliação dos polifenóis nas células cancerosas do sistema digestivo.
Metodologia: Pesquisa bibliográfica em bases de dados como Ovid, Pubmed, Science Direct e Elsevier Journal. Foram selecionados artigos que relatam o efeito biológico dos polifenóis em linhas celulares de câncer do sistema digestivo, publicados entre 2012 e 2022.
Resultados: Vários estudos relataram a utilização de várias linhas celulares como modelos in vitro para estudos de polifenóis no câncer destacando as linhas AGS e HT-29, bem como técnicas para a caracterização de polifenóis, como o ensaio 2,2-Difenil-I-Picril Hidrazil (DPPH). No entanto, para avaliar o efeito biológico, são identificados vários testes que devem ser analisados antes da sua aplicação.
Conclusões: A literatura identifica que existem várias alternativas e estratégias para a avaliação de extratos de plantas em culturas in vitro de câncer do sistema digestivo; no entanto, antes de passar à concepção experimental, é necessário ter em conta uma série de considerações para garantir a utilidade dos resultados.
Palavras-chave: Extratos Vegetais; Polifenóis; Neoplasias, Trato Gastrointestinal; Técnica in vitro; Capacidade de Absorbância de Radicais de Oxigênio; Concentração Inibidora 50; apoptose.
Introducción
El cáncer es una de las principales causas de muerte en el mundo, por lo que las investigaciones orientadas a la búsqueda de herramientas para el diagnóstico, prevención y tratamiento se ha convertido en una prioridad para la ciencia. El cáncer en las vías digestivas es una enfermedad multifactorial que se puede localizar desde la cavidad oral, el esófago, el estómago, porciones del intestino delgado y, finalmente, en el intestino grueso hasta el recto y el ano. En todo el mundo, los sitios más frecuentes para el diagnóstico son estómago, colon, recto y ano (1). Además, el cáncer gástrico y el cáncer de colon se encuentran entre la tercera y quinta causas de mortalidad por cáncer en el mundo. En los países desarrollados ocupan el tercer lugar en frecuencia en los hombres y el segundo lugar en las mujeres, y su tasa de incidencia aumenta en países no desarrollados (1,2), lo que sugiere que los factores ambientales, hábitos dietarios y estilo de vida constituyen un importante factor de riesgo (3).
Los agentes anticancerosos actuales pueden cla sificarse como quimiopreventivos o quimioterapéuticos, según la etapa de la carcinogénesis. Los agentes quimiopreventivos se dividen en agentes de bloqueo, que evitan que los carcinógenos lleguen a los sitios de destino por activación metabólica o al interactuar con macromoléculas como ADN, ARN y proteínas; luego, están los agentes de supresión, que inhiben la transformación maligna de las células iniciadas (4). Para explorar el potencial quimiopreventivo, las células cancerosas deben exponerse a un agente anticancerígeno alternativamente in vitro o en animales para evaluar su respuesta. Existen varios agentes anticancerígenos farmacéuticos obtenidos de productos naturales que en su composición presentan un contenido significativo de polifenoles y han demostrado poseer potentes efectos anticancerígenos y antioxidantes beneficiosos para la salud (1,5).
Los polifenoles hacen parte de una gran variedad de fitoquímicos o metabolitos secundarios producidos por las plantas. Estos comprenden una parte esencial de la dieta humana y son de considerable interés debido a sus propiedades biológicas. Desde el siglo pasado se ha establecido que en plantas estos compuestos se sintetizan principalmente como agentes de defensa contra estimuladores fisiológicos y ambientales (6), y más recientemente en humanos diferentes estudios asocian una dieta rica en polifenoles con una menor incidencia de enfermedades cardiovasculares, trastornos hepáticos, obesidad, diabetes y cáncer, este último asociado con sus propiedades antioxidantes, capacidad de modulación de las vías de señalización, alteración o bloqueo celular, inducción de apoptosis, disminución de inflamaciones y de lesiones preneoplásicas (1,7,8).
Con todo esto, los polifenoles constituyen un grupo de metabolitos ampliamente estudiados y caracterizados. De este modo, se cuenta con una base de datos que incluye 502 polifenoles identificados a partir de 452 alimentos, disponibles desde 2010 y actualizada en 2012 y 2013 (9-11). Sin embargo, en el momento de evaluarlos in vitro se han encontrado resultados poco concluyentes, en cuanto a su potencial y las técnicas más empleadas para determinar su viabilidad celular, que pueden generar falsos positivos o sobrestimaciones (12-15). De ahí que sea necesaria una revisión profunda para evaluar las herramientas más idóneas para su caracterización. Por lo tanto, el objetivo de la revisión fue presentar las técnicas empleadas para establecer la utilidad de los polifenoles como alternativa terapéutica en el manejo del cáncer de vías digestivas.
Metodología
Para la revisión descriptiva se realizó una búsqueda entre mayo y julio de 2022 en las bases de datos Pubmed, Science Direct, Ovid y Elsevier Journal. Se utilizaron las siguientes palabras clave en inglés y español: cáncer, cáncer gástrico, extractos de polifenoles, efecto antineoplásico, citotoxicidad, apoptosis, ensayos de citotoxicidad, que generaron diferentes estrategias de búsqueda combinando las palabras clave con los conectores booleanos: OR, AND y NOT. Se incluyeron artículos originales y revisiones sistemáticas de la literatura publicados en una ventana de tiempo de diez años (2012-2022), en idioma inglés o español con acceso a texto completo. Así, se identificaron 423 artículos por título que fueron sistematizados en una tabla en el programa Excel®, de donde se extrajo la información de la línea celular empleada, la intervención, el comparador (si existe), los métodos de evaluación y los resultados obtenidos. Después del proceso de selección a texto completo y la depuración de duplicados, se incluyeron 55 estudios relacionados con el análisis de polifenoles en cultivos in vitro de células provenientes de neoplasias de vías digestivas. Finalmente, después de revisar las técnicas relacionadas en la literatura, y por la necesidad de describirlas se incluyeron adicionalmente referencias anteriores a este periodo, para brindar la información completa de cada una de las técnicas identificadas y presentadas en esta revisión.
Resultados y discusión
Se recopilaron 55 investigaciones realizadas in vitro donde se evidenció el uso de los polifenoles en el cáncer de vías digestivas, identificando diferentes herramientas y pruebas para evaluar la capacidad quimiopreventiva de algunos polifenoles de extractos vegetales. Varios autores coinciden en que la neoplasia maligna colorrectal es una de las principales causas de muerte en hombres y mujeres (16).
En principio, se identificó que los productos naturales y sus derivados cumplen un rol importante en el manejo del cáncer. Los resultados de estos estudios sugieren que la mayoría de estos extractos tienen propiedades antimicrobianas y anticancerígenas, los cuales pueden usarse en nuevas formulaciones y darles una adecuada importancia para promover su consumo e incorporarlos dentro de los hábitos alimentarios (17,18). Un ejemplo lo podemos tomar de la investigación llevada a cabo por Miyata et al. (19) en Asia, China, Corea del Sur e India, el consumo usual del té verde (Camellia sinensis) de la familia Theaceae ha demostrado un importante efecto protector contra el cáncer de próstata y una disminución del riesgo de cáncer de próstata con un odds ratio (OR) de 0,59. El consumo de más de 3 tazas al día presenta un OR de 0,27, y el consumo de más de 10 tazas al día presenta un OR de 0,67; todos con un intervalo de confianza (IC) del 95 %. Este, como muchos otros estudios, respalda la importancia de continuar con investigaciones sobre polifenoles como alternativa al tratamiento de cáncer.
En este punto es indispensable abordar los modelos in vitro (líneas celulares) y las herramientas que permiten una correcta valoración de las propiedades biológicas y antineoplásicas disponibles para la caracterización de extractos naturales ricos en polifenoles como alternativa terapéutica en las neoplasias de vías digestivas.
Modelos in vitro para estudios de cáncer de vías digestivas empleadas para el análisis de la capacidad antioxidante de los polifenoles
El cultivo de células animales in vitro constituye una de las técnicas más eficaces para la investigación de procesos celulares cuyos resultados han generado gran impacto en el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades (20). Al analizar la literatura obtenida, podemos observar para los estudios de polifenoles en modelos in vitro de cáncer de vías digestivas que se hace hincapié en el cáncer gástrico y en cáncer colorrectal. Para cáncer gástrico, se encontró que las líneas más empleadas de adenocarcinoma gástrico son AGS (21-25), SGC7901 (cáncer gástrico humano) (25-28), MKN45 (25,29,30), MKN28 (23,25,31), MGC803 (25,32,33), EPG85-257P (34), HGC-27 (25) y para cáncer colorrectal, las líneas más utilizadas de adenocarcinoma colorrectal son HT29 (16,35-37), HCT116 (carcinoma colorrectal) (36-
40), SW480 (1,3,37), HCT15 (41), SW620 (39), CaCo2 (36). Dentro de la revisión se encontraron pocos estudios in vitro para probar la eficiencia de los polifenoles en líneas celulares provenientes de cáncer de otros sitios anatómicos de las vías digestivas, identificando el uso de células de adenocarcinoma de esófago (TE-1) (30) y de carcinoma EC109 (42) para evaluar la actividad de productos naturales antioxidantes. Sin embargo, desde el punto de vista de productos sintéticos,existen mayor número de trabajos en los cuales se evalúan diferentes propiedades antineoplásicas en cultivos in vitro. Ello nos genera la necesidad de abordar este tipo de estudios in vitro para evaluar la eficiencia de los polifenoles en otros tipos de cáncer de vías digestivas.
Evaluación de la actividad biológica de los polifenoles
Capacidad antioxidante de los polifenoles
La capacidad antioxidante de frutas y vegetales está ampliamente demostrada, por la presencia de sus polifenoles, además de sus efectos benéficos sobre la salud (43,44), lo cual ha despertado un gran interés en la comunidad científica y generado la necesidad de poder caracterizar estas capacidades de cara a su implementación como alternativas terapéuticas. En nuestra revisión, identificamos cómo la mayoría de los estudios realizaron la técnica 2,2-Difenil-I-Picril Hidrazilo (DPPH), que se basa en la reducción de la absorbancia del radical DPPH y posteriormente su lectura bajo una longitud de onda de 517 nm, que fue la más utilizada en los artículos revisados; sin embargo, no todos presentaron los valores obtenidos (45-49).
Además, se caracterizan mediante la determinación de la concentración media inhibitoria (IC50), técnica que se basa en medir la efectividad de un compuesto para inhibir una actividad biológica o bioquímica, la cual genera mayor información para determinar los extractos potencialmente activos. En este caso, permite establecer la concentración de los extractos vegetales activos (%AA mayor al 25 %) necesaria para disminuir en un 50 % la concentración inicial del radical DPPH, teniendo en cuenta que un IC50 bajo está directamente asociado con una actividad antioxidante alta (50).
Dentro de los criterios de selección para extractos vegetales basados en la determinación de IC50, se consideran de alto potencial antioxidante aquellos con valores menores a 30 µg/mL; con moderado potencial, los ubicados en un rango de entre 30 µg/mL y 100 µg/mL, y de bajo potencial antioxidante, aquellos con un IC50 por encima de 100 µg/mL (51), al analizar solo aquellos extractos que se consideraron activos en el ensayo del DPPH y en las concentraciones más adecuadas para el método.
Entre los estudios revisados, el extracto de mango (Mangifera indica) presentó un contenido de fenoles totales de 217,72 1,35 mg de ácido gálico/100 g (3). Este extracto presenta un alto contenido de polifenoles, indicativos de su gran capacidad antioxidante. Para el extracto del té verde, las catequinas, un tipo de polifenoles presentes en elevados niveles en el té verde, son las encargadas de ese sabor amargo, y durante la revisión (19) no se presentaron datos sobre su capacidad antioxidante.
Determinación de la concentración inhibitoria
La IC50 es una medida de la potencia que presenta una sustancia o la concentración de un compuesto necesaria para reducir o inhibir in vitro una función biológica; en este caso, se trata del crecimiento de las células de cáncer. La mayoría de los estudios realizaron el ensayo MTT (52-55), el cual es un ensayo colorimétrico para evaluar la actividad metabólica celular y el IC50. Cuantifica la actividad realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa y genera como producto un compuesto de color azul denominado formazán. La cantidad de este producto es proporcional a las células vivas, lo que permite determinar la funcionabilidad mitocondrial de las células tratadas y, de esta manera, identificar las células viables. El colorante incoloro XTT (2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -2H-tetrazolio-5-carboxanilida) o tetrazolio de segunda generación también se emplea para ensayos de proliferación celular, y junto con MTT, MTS y WST y un aceptor de electrones 1-metoxi fenazina metosulfato (PMS), es posible acelerar la reducción de estas sales, al aumentar la sensibilidad de la técnica (56,57).
La aplicación de esta técnica se debe a las características del ensayo, el cual permite ser escalado a diferentes volúmenes de cultivo y evaluar en un rango lineal hasta un millón de células (58), y además representa el primer paso en el objetivo de eliminar la dependencia de un radioisótopo para la cuantificación de la viabilidad celular (52) y convertirse en el ensayo de citotoxicidad más empleado. Recientemente, hubo varias controversias frente a este ensayo, debido a que varios autores reportaron inconsistencias, en cuanto a que sobrestiman o subestiman el número de células presentes y por tanto la viabilidad celular. A este respecto, la reducción de MTT en este ensayo la pueden modular significativamente diversos factores metabólicos, energéticos, cambios en la actividad de oxidorreductasas, endo-/exocitosis y tráfico intracelular. Además, este error de estimación de la viabilidad celular por el ensayo MTT puede deberse a la reprogramación adaptativa metabólica y mitocondrial de las células sometidas al estrés, mediado por el tratamiento farmacológico o por los efectos del inhibidor. De ahí que hayan concluido que, para evitar una mala interpretación de los resultados, se recomiende la suplementación de los ensayos basados en sales de tetrazolio (MTT y sus variantes) con otros ensayos no metabólicos (12).
Otros autores demostraron en sus experimentos que el MTT presenta afinidad para unirse a gotas de lípidos, por lo cual debe evitarse esta técnica cuando se utilizan liposomas en la formulación de las moléculas de prueba (13). Gómez Pérez et al. (14) demostraron que pequeñas concentraciones de cobre interfieren con el ensayo del MTT, y de igual manera se ha demostrado la interferencia en extractos metanólicos de plantas y generado una sobrestimación de la viabilidad celular (15). Van Tonder et al. (59) demostraron que en presencia de compuestos con potencial de óxidoreducción el ensayo MTT fue menos preciso para detectar cambios en el número de células en el rango lineal, y una mayor variación en las concentraciones de IC50 de los inhibidores de la glucólisis probados. A su vez, en general, el ensayo sulforrodamina B (SRB) se desempeñó mejor, teniendo en cuenta todos los parámetros evaluados; de ahí que se haya sugerido como el ensayo más adecuado para su uso en la detección preclínica de nuevos compuestos terapéuticos con potencial óxido-reductor.
En un estudio donde se evaluó la miel como alternativa antineoplásica se demostró que la miel es citotóxica hacia las células de cáncer de próstata PC3 y DU145, mediante diferentes ensayos de citotoxicidad. En sus resultados, se muestra que el ensayo MTT presentó errores debidos a la reducción del reactivo MTT por los azúcares reductores de la miel y los compuestos fenólicos; mientras que el ensayo no metabólico de SRB arrojó resultados válidos en cuanto a la cantidad de células, con la desventaja de que solo mide proteínas y no aporta información sobre el estado de las células presentes. También se realizó un ensayo microscópico de tinción con yoduro de propidio y Hoechst, el cual proporcionó información morfológica sobre el mecanismo de muerte celular. Finalmente, se concluyó que la combinación de los ensayos de SRB y yoduro de propidio/Hoechst proporcionaría la cuantificación más precisa de la citotoxicidad de la miel (60). En otro estudio donde se evaluaba el efecto del extracto natural de uva sobre células de cáncer de colon se empleó el ensayo de SRB satisfactoriamente (38).
De estos hallazgos se infiere que aun cuando el ensayo del MTT es el test de citotoxicidad más utilizado, antes de implementarlo es precisa una revisión exhaustiva para descartar la existencia de alguna interferencia en los estudios que se vaya a realizar. De igual manera, podemos afirmar que emplear pruebas no metabólicas con el ensayo de SRB nos permite tener una prueba de medición que se puede aplicar ampliamente en nuestros estudios con una muy buena sensibilidad y sin la presencia de posibles interferencias originadas por las moléculas que se van a evaluar.
Evaluación de la apoptosis o muerte celular
En las áreas biomédicas, el estudio de los cambios biológicos que llevan a la muerte celular ha sido tema de continua investigación para su entendimiento y aplicación. Los cambios moleculares, bioquímicos y morfológicos que se dan en un proceso de muerte celular y las consecuencias que generan estos en los tejidos que las contienen han sido cada vez más detallados, gracias a la implementación de metodologías que permiten la elucidación de algunos de estos mecanismos. La técnica de cultivo de células animales se ha convertido en un modelo para identificar la apoptosis celular y detectar eventos particulares de este proceso y mecanismos asociados con este. Los métodos para la detección de apoptosis son variados; sin embargo, se han clasificado en ensayos mitocondriales y otras técnicas que miden alteraciones citomorfológicas, fragmentación de ADN, alteraciones de membrana y detección de caspasas, descritos en la tabla 1. Para la aplicación de cada uno de estos se deben tener en cuenta las características particulares del tipo celular cultivado, así como el objetivo de caracterización que se pretende alcanzar, restricciones técnicas, costos, entre otros (61).
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Método de detección |
Ensayo |
Principio |
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Ensayos mitocondriales |
MTT |
Cuantifica la cantidad de células viables durante el crecimiento celular a través de la actividad metabólica de las células. (56,57) |
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Alteraciones citomorfológicas |
Tinciones histológicas y visualización mediante microscopio de luz o microscopio electrónico de transmisión (TEM) |
Es considerada el gold standard para confirmar el estado apoptótico en una célula al poderse observar la membrana celular intacta, desorganización de organelos citoplasmáticos, aumento de tamaño vacuolar, formación de protuberancias irregulares, fragmentación nuclear (62) |
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Fragmentación del ADN |
Marcado de final de corte de dUTP de Terminal deoxinucleotidil transferasa o TUNEL |
Utiliza la enzima didesoxinucleotidiltransferasa terminal exógena (TdT) para incorporar nucleótidos marcados en el extremo OH 3’ de cadenas de ADN fragmentado, los cuales se detectan directa o indirectamente (por ejemplo, a través de biotina o digoxigenina) mediante el uso de trifosfodesoxinucleótidos marcados colorimétrica o fluorescentemente mediante un proceso enzimático. (63) |
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Alteración de membrana |
Marcaje celular simultáneo con Anexina V FITC y yoduro de propidio (PI) |
Permite la discriminación de las células intactas, células en apoptosis temprana, células en apoptosis tardía y células en necrosis. (64) |
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Actividad enzimática de las caspasas |
Western Blot |
Las caspasas son un grupo de cisteínil-aspartato proteasas caracterizadas por poseer un residuo de cisteína responsable de la proteólisis de otras proteínas en residuos de aspartato. Estas caspasas están presentes de forma latente en células animales y son activadas en procesos de apoptosis (65,66). |
Estas técnicas se han identificado en diversos estudios para estudiar el efecto de polifenoles en el cáncer, como el reporte de Liu y Li (30), donde emplearon la caracterización morfológica de las células mediante la doble tinción con naranja de acridina y bromuro de etidio, para evidenciar la reducción del volumen celular y la condensación de la cromatina en células MKN-45 y TE-1. Otro estudio en células de cáncer gástrico SGC-7901, donde se evaluaba el resveratrol, emplearon la tinción con DAPI para evaluar la morfología del núcleo (27).
El ensayo de TUNEL se ha aplicado ampliamente en diferentes tipos de estudios y ha resaltado la determinación de apoptosis en células hepáticas sometidas a extractos de mora (Morus alba L.) (67). Por otra parte, el marcaje celular simultáneo con anexina V FITC y yoduro de propidio (PI) se ha reportado en la evaluación de apoptosis inducidas por polifenoles como el resveratrol (27,68-70), extracto de vino rojo (39) y extracto de repollo blanco (24).
Aun cuando los autores emplean diferentes métodos para la cuantificación de la apoptosis, las últimas tendencias indican la cuantificación de proteínas relacionadas con las rutas de apoptosis mediante la técnica de Western Blot, para tener una representación precisa de los procesos bioquímicos que están ocurriendo en las células (30,67,70).
Los hallazgos de estos estudios evidenciaron un mayor número de estudios que emplean la técnica dependiente de la anexina V para identificar la alteración de la membrana, ya que esta va a permitir evaluar el estado de todas las células estudiadas y discriminar la apoptosis de procesos de necrosis en el cultivo. Adicionalmente, hay una clara tendencia a evaluar las caspasas y los genes que regulan el ingreso a la apoptosis por Western Blot. Sin embargo, ya que todas se han empleado sin ningún inconveniente reportado, la técnica que se elija va a depender del equipamiento disponible en nuestro laboratorio, y de ser posible, incluirá siempre la determinación de mediadores apoptóticos por Western Blot.
Conclusiones
Los extractos naturales ofrecen una fuente de compuestos y productos con posibles efectos antineoplásicos, principalmente los que contienen altas concentraciones de polifenoles. Su estudio requiere identificar cuáles son las mejores alternativas experimentales para llevar a cabo estos procesos de una forma costoeficiente y con resultados de calidad y significancia estadística. En nuestro estudio, identificamos que la caracterización de la capacidad antioxidante se puede determinar con la IC50 en el ensayo del DPPH. Sin embargo, en las pruebas in vitro, si bien la gran mayoría utiliza ensayos de citotoxicidad basados en sales de tetrazolio, es importante resaltar que esta técnica emplea en su principio reacciones de óxido-reducción que pueden ser alteradas por la presencia de los polifenoles en los extractos probados, por lo que recomendamos pruebas colorimétricas enfocadas en el marcaje de proteínas con el ensayo de sulforhodamina B.
Recomendaciones
Posterior al análisis de la información plasmada, se recomienda generar una investigación de mayor nivel, como una revisión de alcance o una revisión sistemática de la literatura, donde se evalúen sesgos y se determine si existe una alteración de los resultados de las pruebas que emplean sales de tetrazolio, por la presencia de compuestos como los polifenoles o los extractos que los contengan. Por otra parte, de precisarse el uso de estos métodos de determinación de densidad celular, se recomienda validar los resultados, incluyendo los controles apropiados que permitan evaluar el efecto de los polifenoles sobre el método de cuantificación.
Limitaciones
Las limitaciones del estudio comprenden la poca evidencia reportada y disponible en los últimos cinco años.
Financiación
Esta investigación fue financiada por la Universidad de Boyacá.
Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
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